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摘要：毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。該技術(shù)可分析的成分小至有機(jī)離子、大至生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等。可用于分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等，比HPLC分析、快速、微量。
關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳 原理 分離模式 應(yīng)用
1、概述
毛細(xì)管電泳 (Caillary Electrophoresis)簡稱 CE，是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流場為驅(qū)動力的新型液相分離分析技術(shù)。CE的歷史可以追溯到 1967年瑞典Hjertenzui先提出在直徑為3mm的毛細(xì)管中做自由溶液的區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他沒有*克服傳統(tǒng)電泳的弊端[1]。
現(xiàn)在所說的毛細(xì)管電泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他們使用了75mm的毛細(xì)管柱，用熒光檢測器對多種組分實現(xiàn)了分離。1984年Terabe將膠束引入毛細(xì)管電泳，開創(chuàng)了毛細(xì)管電泳的重要分支: 膠束電動毛細(xì)管色譜(MEKC)。1987年Hjerten等把傳統(tǒng)的等電聚焦過程轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。同年，Cohen 發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。近年來，將液相色譜的固定相引入毛細(xì)管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴(kuò)大了電泳的應(yīng)用范圍。
毛細(xì)管電泳和液相色譜（HPLC）一樣，同是液相分離技術(shù)，因此在很大程度上HPCE與HPLC可以互為補(bǔ)充，但是無論從效率、速度、樣品用量和成本來說，毛細(xì)管電泳都顯示了一定的優(yōu)勢毛細(xì)管電泳（C E） 除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點外，其儀器結(jié)構(gòu)也比液相色譜（HPLC）簡單。 C E只需高壓直流電源、 進(jìn)樣裝置、 毛細(xì)管和檢測器。
毛細(xì)管電泳具有分析速度快、分離效率高、試驗成本低、消耗少、操作簡便等特點，因此廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、材料學(xué)以及與化學(xué)有關(guān)的化工、環(huán)保、食品、飲料等各個領(lǐng)域[2]。
2 毛細(xì)管電泳的設(shè)備和基本原理
毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法[3]。毛細(xì)管電泳儀的基本組成如圖1、1 所示 。
熔融石英毛細(xì)管的兩端分別浸在含有電解緩沖液的貯液瓶中，毛細(xì)管內(nèi)也充滿同樣的電解緩沖液。在毛細(xì)管接收端之前安裝在線檢測系統(tǒng)。被分析樣品可以從進(jìn)樣系統(tǒng)采用重力法、電遷移法、抽真空法等多種進(jìn)樣方式引入到毛細(xì)管的進(jìn)樣端。當(dāng)樣品被引入后,便開始在毛細(xì)管兩端施加電壓 。樣品溶液中溶質(zhì)的帶電組分在電場的作用下根據(jù)各自的荷質(zhì)比向檢測系統(tǒng)方向定向遷移。CE中的毛細(xì)管目前大多是石英材料。當(dāng)石英毛細(xì)管中充入 pH值大于 3的電解質(zhì)溶液時 ,管壁的硅羥基(- SiOH)便部分解離成硅羥基負(fù)離子(- SiO-) ,使管壁帶負(fù)電荷。在靜電引力下 ,- SiO-會把電解質(zhì)溶液中的陽離子吸引到管壁附近，并在一定距離內(nèi)形成陽離子相對過剩的擴(kuò)散雙電層 (見圖 2[4])。
在外電場作用下 ,上述陽離子會向陰極移動。由于這些陽離子實際上是溶劑化的(水化的)，它們將帶著毛細(xì)管中的液體一起向陰極移動，這就是 CE中的電滲流(EOF)。電滲流的強(qiáng)度很高，以致于所有進(jìn)入毛細(xì)管中的樣品，不管是陰離子、陽離子或中性分子，都會隨著液體向陰極移動。因待測樣品中正離子的電泳方向與電滲流方向一致，故zui先到達(dá)毛細(xì)管的陰;中性粒子的電泳速度為零 ,遷移速度與電滲流速度相當(dāng)；而負(fù)離子的電泳方向則與電滲流方向相反，但因電滲流速度約等于一般離子電泳速度的 5～7倍[5]，故負(fù)離子也將在中性粒子之后到達(dá)毛細(xì)管的陰。由于各種粒子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速度不一致，因而使各種粒子在毛細(xì)管內(nèi)能夠達(dá)到很好的分離。
3 毛細(xì)管電泳的分離模式
根據(jù)分離原理不同，CE分離基本模式有6種，如表 1 所示。
以上各模式以毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動毛細(xì)管色譜這3種應(yīng)用較多。
4 、毛細(xì)管電泳的應(yīng)用
4.1 CE在藥物成分分析中的應(yīng)用
目前，CE在天然中草藥分析領(lǐng)域中的應(yīng)用主要集中在生物堿和黃酮及其甙類方面、蒽醌類分析也有報道。生物堿有類似于堿的性質(zhì)，在pH < 7的緩沖液中利用 CZE 分離。紀(jì)秀紅等[6]選取馬qian子jian為內(nèi)標(biāo)物，在磷酸/甲醇緩沖溶液中 ,測定了小檗堿、巴馬亭、藥根堿的含量。黃酮類化合物大多是中性分子，主要采用 MECC 模式分離。LiYM[7]以SDS(十六烷基磺酸鈉)為陰離子表面活性劑將黃芩中的 6 種主要的黃酮類化合物分離。李偉等[8]以磷酸鹽為緩沖體系 ,利用 CZE模式分離、 測定了大黃提取液中離蒽醌化合物的含量。
4. 2 CE在手性拆分中的應(yīng)用
CE因其、快速、選擇性強(qiáng)的特點而成為目前zui有效的手性拆分方法。各種CE分離模式皆可用于對映異構(gòu)體分離，因此手性拆分成為 CE應(yīng)用zui活躍、 zui*的領(lǐng)域。其中，添加劑法只需向電泳緩沖液中加入合適的手性試劑，經(jīng)過一定的分離條件優(yōu)化即能實現(xiàn)手性分離。又因為可選擇的添加劑種類很多，此法是 CE進(jìn)行手性拆分的主要形式。目前 ,主要的手性添加劑有環(huán)糊精類（CDs)、冠醚類、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)等。僅環(huán)糊精一類就有α-CD，β-CD，γ-CD，HP-α-CD， CM-β-CD 等多種添加物質(zhì) ,其應(yīng)用十分廣泛。此外，其他種類添加劑的應(yīng)用結(jié)合 MECC和 NACE 模式基本上能實現(xiàn)各種手性藥物的拆分[9～11]。
4.3 CE用于肽和蛋白分析
CE在蛋白質(zhì)分離分析中的應(yīng)用主要包括肽和蛋白的鑒別分析、結(jié)構(gòu)分析、微量制備，蛋白的定量測定、純度檢測、非均一性檢測、定性和動力學(xué)研究。CE在肽和蛋白質(zhì)的別分析中應(yīng)用zui多的是CZE測定肽譜， SDS-CGE測蛋白分子量及CE-MS直接測定分子量。用CZE還可測定蛋白的物理參數(shù)，如蛋白的有效尺寸、電荷和擴(kuò)散系數(shù)。用CIEF測定蛋白等電點比平板凝膠電泳測等電點的方法簡單
4.5 CE在臨床化學(xué)上的應(yīng)用
CE 在臨床化學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛, 所檢測樣品的來源可分為尿樣、血漿血清、腦脊液、紅細(xì)胞、其它體液或組織以及實驗動物活體(invivo)試驗。被分析的組分則包括肽類、各種蛋白、病毒、酶、糖類、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、離子、藥物及其代謝產(chǎn)物。具體應(yīng)用可分為: 臨床疾病診斷 臨床蛋白分析、 臨床藥物監(jiān)測、代謝研究、病理研究、同工酶分析、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR )產(chǎn)物分析、DNA pian斷及序列分析等。所應(yīng)用的CE 模式包括CZE、MECC、CGE、 CITP 和毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)[13.14]。
4.6 CE用于檢測非均一性(多樣性, Heterogeneity)
許多純化蛋白, 甚至在它們的天然狀態(tài), 往往都不是單一分子片斷, 而是由相關(guān)分子組成, 稱為非均一性(多樣性)。產(chǎn)生多樣性的原因有: 氨基酸(AA )的序列不同, 如突變體的某位置AA 改變或AA 側(cè)鏈改變; 后轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生不同長度的多肽鏈; 糖蛋白不同程度的糖基化, 如存在不同數(shù)量的寡糖鏈, 寡糖鏈有不同的單糖組成、 序列及單糖之間的異構(gòu)連接。 采用CZE, MECC, CIEF, CE-MS 可檢測這些非均一性。用于心臟病的重組人組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rtPA )含 4 個可能糖基。Yim [15]用 CZE 和CIEF 研究了制備過程中 rtPA 不同糖基化程度引起的非均一性, 結(jié)果表明, CIEF方法要比CZE的好。還有用CZE 對人促紅細(xì)胞生成素( rHuEPO )[16]、用MECC對重組人C2干擾素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研究蛋白的多樣性。有關(guān)蛋白的非均一性在臨床中的一些應(yīng)用, 如人鐵傳遞蛋白、血清蛋白的變異、異構(gòu)酶的分析等。
4. 7 CE用于農(nóng)藥殘留量的分析
對農(nóng)藥殘留物的測定國外研究的較多。Lazer等[19]將飛行時間質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳儀聯(lián)用，采用樣品堆積技術(shù)進(jìn)樣對 Paraquat 和 Diquat 兩種除草劑進(jìn)行了分離，檢測限低至 10- 17mol/L。Farran等[20]采用φ(乙腈) = 50 %的磷酸-硼砂緩沖液分離出兩種苯氧羧酸類除草劑。Hinsmann 等[21]通過自動在線濃縮樣品， 采用固相微柱以十二烷基硫酸鈉(SDS)作膠束 ,添加少量乙腈 ,在13min內(nèi)分離測定了水中的7種不同種類的農(nóng)藥。磺酰脲類化合物是一類相對較新的除草劑 ，因此這一類化合物在水和食品中的殘留量的測定十分重要。Lipez Avila等[22]采用3μmODS硅膠填充柱來分離這一類化合物 ,線性范圍為1～100mg/L。Mayer等報道了農(nóng)藥Cinosulfuron 及其副產(chǎn)物的毛細(xì)管電色譜的分離分析。游靜等[23]對毛細(xì)管電泳在農(nóng)藥手性拆分的進(jìn)展做了綜述。
4.8 CE用于純度檢測
CE在國外分子生物學(xué)實驗室及生物工程藥廠里已廣泛用作zui有效的純度檢測手段。當(dāng)?shù)鞍椎氖杷韵嘟鼤r, 它們在HPLC 柱中往往同時流出, 因此在對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究(包括N 端序列和肽譜)之前, 必須監(jiān)測從HPLC 所得肽片斷的純度。快速CE 純度檢測可節(jié)約樣品和節(jié)省序列測定所需時間。因CE 和RP2 HPLC 分離機(jī)理不同, 所以當(dāng)用CE 檢查由RP2HPLC 純化制得的某一合成肽(一個峰, 純度為 99.12% )時, 發(fā)現(xiàn)分出 6 個組分, 主峰純度僅為50%。或許這就是部分基因工程產(chǎn)品用HPLC 檢測純度很高而實際生物活性卻各批差異很大的一個原因。至于用CE 對藥廠生產(chǎn)及QC 作純度檢測的應(yīng)用實例比比皆是, 如對胰島素、白細(xì)胞介素、人生長激素、粒性巨噬細(xì)胞菌落刺激因子(用CIEF )等的檢測。純度檢測時用CE 可檢測出多肽鏈上單個氨基酸的差異。CE 用于純度檢測可用CZE,MECC, SDS2 CGE, CIEF 多種模式。還有文獻(xiàn)討論了用不同方法(包括RP2 HPLC, IEC2 HPLC, SDS2PA GE 及CE)進(jìn)行純度檢測的zui有效的策略[24]。
5 結(jié) 論
作為一種蛋白質(zhì)、多肽、核酸及其他生物分子分離和分析的重要技術(shù)，近20年來，毛細(xì)管電泳的機(jī)理探索和應(yīng)用研究都取得了長足的進(jìn)展，對毛細(xì)管電泳的研究， 使其分離效率和分析精度不斷提高，也使其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，推動了生物技術(shù)的不斷發(fā)展。毛細(xì)管電泳今后發(fā)展方向仍是繼續(xù)提高分辨率、速度和檢測器的選擇性。同時，增加自動進(jìn)樣裝置和使之微機(jī)化、商品化。另外，將它與質(zhì)譜儀更好地結(jié)合，可對生物分子特性作出更快、更準(zhǔn)確的分析，以進(jìn)一步拓寬毛細(xì)管電泳在生物領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。
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